基底模量已被广泛认可是影响细胞行为和功能的关键因素之一。例如，低模量基底促进神经突延伸，而抑制神经胶质细胞迁移和增殖。人源间充质干细胞（hMSCs）可在与相应组织模量相似的基底上分别分化为神经元、成肌细胞和成骨细胞（弹性模量E为0.1-40 kPa）。多种因素尤其是模量的有效解耦对于厘清不同材料表面性质对细胞行为的影响至关重要。目前关于基底模量对于体外细胞行为影响的众多结果尚未系统地与具有更复杂的生物力学、化学和拓扑特征的体内真实微环境相关联。尤其是，在对于模量迥异的硬、软两种类型的组织进行修复，在材料的力学需求上是否具有倾向性，是组织工程和生物材料领域的重要问题。
近日，中山大学材料科学与工程学院王山峰教授团队为全面、系统地回答这个问题，以“Opposite Mechanical Preference of Bone/Nerve Regeneration in 3D-printed Bioelastomeric Scaffolds/Conduits Consistently Correlated with YAP-Mediated Stem Cell Osteo/Neuro-genesis”为题发表在《Advanced Healthcare Materials》上（DOI：10.1002/adhm.202301158）。文章第一作者为中山大学材料科学与工程学院2019级博士毕业生成肖鹏，主通讯作者为其导师王山峰教授。相关成果该研究得到国家自然科学基金（51973242和81602205）和中山大学“百人计划”启动经费的支持。在这项工作中，作者首先制备了一种新型可光固化非晶型聚合物：聚三亚甲基碳酸酯富马酸酯（PTMCF，中国发明专利申请号：202011000150.4），通过调控前驱体分子量可有效调控交联网络的力学性能，而不改变其表面性能包括浸润性和蛋白吸附能力。该聚合物可通过模具法和面投影微立体光刻技术（PμSL）分别制备具有单因素变量（模量）的二维基底和三维支架，并分别用于研究模量对体外人源间充质干细胞行为以及体内软硬组织再生的影响（图1）。
图1. 生物可降解弹性体调节hMSCs的命运和体内骨/神经组织再生。
通过改变前驱体分子量（500、1000和2000 g/mol：0.5k、1k和2k）可有效调控交联网络力学性能（图2a,b），PTMCF0.5k、1k和2k的拉伸模量（E）分别为：990 ± 80 kPa、680 ± 130 kPa和90 ± 11 kPa。在PBS中模拟降解长达两年后，PTMCF0.5k、1k和2k的残余质量比分别为44 ± 9%、59 ± 7%和66 ± 13%（图2c）。此外，PTMCF网络具有简易合成、透明、可打印性、可生物降解性、优异的E和断裂伸长率（εbreak）等特点，总体上优于大多数已报道的弹性体（图2d）。图2e为众多弹性体的E与εbreak的Ashby图，以比较PTMCF弹性体与现有报道的光固化打印生物可降解弹性体和用于细胞力学信号传导的弹性体。这里可以看到PTMCF弹性体的εbreak可以达到550%，在两对比组中优于大多数文献报道的弹性体，且PTMCF的E位于常用于调节干细胞命运的模量范围内。
图2a. PTMCF生物弹性体的力学性能：（a）应力应变曲线和（b）拉伸与剪切性能统计；（c）37 °C 下PTMCF网络在PBS中的降解曲线。（d）PTMCFs与典型生物弹性体在简易合成、透明度、生物降解性、拉伸模量、断裂伸长率和归一化可打印性的比较。（b）PTMCF、立体光刻打印生物降解弹性体和细胞力学传导弹性体的εbreak和E的Ashby图。
PTMCF0.5k与2k中较高密度的碳碳双键可以保证打印的流畅性。此外，由于PTMCF0.5k的超低粘度，其树脂中的聚合物成分可高达90%。优化聚合物树脂配方以及打印参数后采用PμSL打印了高分辨率的三维gyroid骨修复支架结构、单通道神经导管和血管网络（图3a），而且PTMCF神经导管具有较高的柔韧性，可以抵抗弯曲、扭转等变形而不被破坏且可回复至最初形状（图3b）。更重要的是，用于体内股骨和坐骨神经修复的支架和导管具有相似的三维微结构和不同的力学性能：PTMCF0.5k和2k骨支架的压缩模量分别为580 ± 90和85 ± 13 kPa，PTMCF0.5k和2k神经导管的法向刚度分别为8.5 ± 1.4和1.6 ± 0.3 N/mm。
图3. Gyroid支架、单通道神经导管和血管网络支架（从左至右）模型图以及相应的实物SEM图。（b）PTMCF2k神经导管的柔韧性展示。（c）PTMCF0.5k和2k的gyroid支架的压应力应变曲线，（d）神经导管径向压缩力-位移曲线。
当模量处于90-990 kPa范围内，hMSCs粘附、增殖与模量（刚度）呈正相关。细胞粘着斑蛋白（FAs）是细胞感应外界机械力的中心枢纽，亦是整合素-细胞外基质连接细胞骨架的桥梁。图4a结果表明高模量基底上的hMSCs通过募集更多的FAs从而进行细胞铺展。整合素-FAs已被发现可介导Hippo通路并与Yes-associated protein（YAP）产生相互作用。这里作者发现YAP对于FAs的形成以及细胞铺展至关重要（图4a）。相较抑制YAP的转录活性，在无YAP抑制条件下的hMSCs表现出模量依赖性，模量介导YAP转录活性（图4b,c）。通过基因和蛋白表明发现在模量位于90-990 kPa范围内，较硬基底可显著促进hMSCs成骨分化，较软基底可促进hMSCs成神经分化，且YAP转录活性是驱动hMSCs分化的关键（图4d）。
图4. （a）使用或不使用YAP抑制剂verteporfin在PTMCF基底上培养hMSCs 一天后的三重免疫荧光染色。（b）hMSCs在PTMCF不同模量基底上培养1d的细胞响应机制。（c）定量分析不同PTMCF基底上hMSCs的YAP核质比。（d）qRT-PCR分析PTMCF基底上培养不同时间的hMSCs成骨相关基因和成神经元相关基因表达。
将3D打印支架植入SD大鼠股骨髁缺损模型，8周后进行观察（图5a）。植入的gyroid支架可为体内的细胞增殖、迁移和分化提供适宜的生理环境。结果表明高模量支架可显著促进大鼠股骨修复（图5b）。将3D打印导管植入SD大鼠坐骨神经缺损模型，在修复过程中进行电生理测试，并在12周后进行组织切片染色观察等（图5c），结果表明适宜的低基质模量可以加速雪旺细胞的的迁移增殖，促进宾格内氏带（Bungner''s bands）的形成，进而促进新的神经纤维和髓鞘形成。基质模量可以影响大鼠周围神经恢复，且适宜的低模量可以促进其恢复，显示出与骨组织修复相反的趋势。
图5. （a）3D打印支架用于体内股骨修复以及（b）8周后修复样本的计算机断层扫描三维重构图片。（c）3D打印导管用于体内坐骨神经修复以及（d）12周后修复样本截面的组织切片然和和透射电镜图。
通过转录组学得到的模量介导周围神经修复潜在机制：适宜的模量可促进细胞整合素表达，激活FAK磷酸化并进一步活化Rho家族蛋白，从而激活下游蛋白以形成Arp2/3复合物，促进肌动蛋白成核与聚合，并形成丝状伪足、微突起和板状伪足，促进神经元生长并进一步修复周围神经（图6）。上述结果揭示了在低于1 MPa基底或支架模量上体外hMSCs响应和体内骨与神经组织修复的影响趋势。作者特别选择了更有争议的周围神经作为代表使用RNA测序在转录组水平上探索基底模量介导周围神经的潜在机制。对于特定的细胞和组织为什么会存在一个最佳的模量范围，以及在组织修复过程中，最佳模量范围的基底在体内微环境中是如何促进组织修复的，这是组织工程领域中的关键但目前尚未完全阐释清楚的科学问题。未来需要完成更全面和更深入的实验，如制备更宽范围的模量基底与支架以及多组学数据间的关联从而探寻上述的最佳模量范围以及深入研究模量介导的骨和周围神经修复的作用机制。
图6. 模量介导周围神经再生的潜在机制示意图。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202301158
