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上海交大张洪斌教授课题组《Acta Biomater.》:胞外多糖双网络水凝胶作为仿生细胞外基质促进关节软骨再生
2022-09-18  来源:高分子科技

  关节软骨由结构复杂、含量丰富的细胞外间质(ECM)和稀疏分布的软骨细胞组成。尽管关节软骨在关节负载和运动过程中提供了良好的力学和润滑性能,但是由于没有血管和神经,受损软骨组织的自愈和再生能力非常有限。水凝胶具有结构和生物化学上的仿生学特性,被认为是能实现软骨再生的材料。其中的多糖水凝胶具有仿生网络、高含水量、细胞相容性和生物降解性,是构建仿生ECM的理想候选材料。然而大多数传统多糖水凝胶的力学性能较差,难以用作在力学强度和综合性能方面有高要求的组织工程材料。构建高性能生物支架材料作为人工ECM来促进软骨再生仍是一个挑战。


  在组织工程用水凝胶制备原材料方面,多糖的应用一直受到关注,主要是因为具有优异的生物相容性及可生物降解性。特别是由透明质酸(HA)制备的水凝胶已被应用于组织工程领域HA是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基葡萄糖胺二糖重复单元组成的线性聚阴离子胞外多糖。作为人体内天然细胞外基质的关键组分HA在细胞增殖和迁移、胚胎发育、组织和血管生成中发挥着至关重要的作用。然而,单独由HA制备的单网络(SN水凝胶的主要缺点不仅是力学性能差,而且在体内也易于降解。此外,由于低浓度下高分子量的HA溶液即具有极高粘度,籍提高浓度获得高力学性能HA凝胶的思路难以奏效,也不能解决HA易降解的难题。


  已有研究显示,由不对称网络组成的双网络(DN)水凝胶可具有高韧性和高杨氏模量。为提高多糖水凝胶作为仿生ECM的力学性能和耐降解性,本研究提出了一种低多糖总浓度下构建可注射、坚韧且力学性能可恢复的透明质酸/结冷胶(HA/GG)双网络水凝胶的策略。结冷胶GG)也是一种胞外多糖,由微生物Sphingomonas elodea发酵制得,已被美国食品药物监督管理局批准用于食品、化妆品和医药领域。GG主链的重复单元由两个β-D-葡萄糖一个β-D-葡萄糖醛酸和一个α-L-鼠李糖单元组成。该多糖可以被一些金属离子交联形成物理水凝胶。但单独由GG形成的水凝胶力学性能也不高,且脆性亦大。


  本研究基于在胞外多糖水凝胶体系中整合共价交联和离子交联的方法,通过形成不对称双网络来提高水凝胶的力学性能,并延缓HA的降解动力学,同时促进软骨细胞的粘附和增殖,支持成熟软骨组织的形成。在制备中,首先是将呋喃改性的HAHA-furan)与星形四臂马来酰亚胺聚(乙二醇)((MAL)4PEG)交联形成HA水凝胶作为第一共价交联网络,其中的呋喃基团可以与马来酰亚胺基团经由Diels-AlderD-A点击化学发生交联。然后是在体系中引入Ca2+,使GG交联形成第二个物理交联网络。GGCa2+之间的离子键可以提高双网络水凝胶的力学强度、抗疲劳性和自恢复性能。第一和第二网络的力学性能除可通过调节多糖的分子量和浓度,还可分别通过调节HA-furan的浓度和取代度以及Ca2+浓度方便地加以调控。


  在总多糖浓度仅为2% wt的情况下,所制备HA/GG双网络水凝胶的杨氏模量达28.6 kPa,抗压强度208.9 kPa,并具有较高的韧性(耗散能为2837 J/m3),60天内仅发生10%的降解。体外研究显示,该水凝胶能促进软骨细胞增殖、显著支持软骨ECM特异性硫酸化糖胺聚糖和II型胶原的沉积,促进软骨组织的形成。兔软骨缺损模型研究也显示,凝胶能显著促进兔软骨再生。此外,研究中采用的这两种胞外多糖具有明确的化学结构和重复单元,可控的分子量和分子量分布,也使凝胶的各种性能易于精确控制。本研究为制备具有适合力学性能、耐透明质酸酶降解的HA/GG水凝胶,作为仿生细胞外基质支架材料用于软骨微创修复提供了有用信息。

 

图1 HA/GG双网络水凝胶作为仿生ECM用于兔软骨缺损再生示意图。


 图2 HA-呋喃衍生物的合成及HA/GG双网络水凝胶的原位成胶性能和可注射性。


 图3 HA/GG双网络水凝胶的力学性能。


 图4 HA和GG单网络水凝胶、HA/GG双网络水凝胶中软骨细胞相关分泌的组织学分析。(A)Safranin-O/FG染色,(B)Masson染色,(比例尺200 μm)。


 图5 HA和GG单网络水凝胶、HA/GG双网络水凝胶中培养的F-肌动蛋白鬼笔环肽染色的软骨细胞荧光图像(A);软骨细胞分泌的软骨基质相关II型胶原的免疫组化染色图像(B)(比例尺200 μm)。


 图6 HA和GG单网络水凝胶、HA/GG双网络水凝胶中培养的软骨细胞中COL II(A)、SOX-9(B)、聚集蛋白聚糖(C)和COL X(D)的基因表达水平。


 图7 形成的新软骨定量评估:杨氏模量(A)、DNA含量(B)、GAG含量(C)和总胶原蛋白含量(D)。


 图8 兔软骨缺损修复性能:(A)软骨关节的宏观图像(比例尺1 cm);(B~D)术后12周缺损区域的组织学染色(比例尺200 μm);(E)再生软骨的ICRS宏观评分;(F)O''Driscoll组织学评分。


  该工作以Double– network hydrogel based on exopolysaccharides as a biomimetic extracellular matrix to augment articular cartilage regeneration”为题发表Acta Biomaterialia》。上海交通大学化学化工学院蔡志祥博士后为该文第一作者,张洪斌教授为通讯作者,上海市第九人民医院唐艳梅医师为共同作者。该研究获得了国家自然科学基金(2177407521074071、博士后基金2020T1304112020M6813082021M692211和上海市扬帆计划(21YF1423800)的资助。


  论文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1742706122005438

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(责任编辑:xu)
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