骨骼肌通过肌腱附着在人体的骨骼上，并产生身体各个部位的运动，比如走路和呼吸。骨骼肌的功能可能会受到肌肉疾病和神经肌肉疾病的影响，例如杜氏肌营养不良症和肌萎缩侧索硬化症。目前科学家们使用实验室人工培养的骨骼肌细胞来研究这些疾病的病理，并培养相关疾病模型用于新药设计筛选。然而骨骼肌组织由于其复杂的结构和高强度的收缩性质，在细胞培养皿中是很难完全复制培养的。在人体中，肌纤维的骨骼肌细胞是被细胞外基质支撑包围着， 并引导人体内骨骼肌组织结构的排列、生长和功能。如果没有类似的支撑结构，实验室培养的肌肉是无法达到研究肌肉疾病所需的更接近人体的肌肉。目前文献报道的肌肉培养方法还受限于复杂耗时的高成本制造步骤和测试方法。
近日，伦敦大学学院外科重建与再生生物材料中心主任宋文辉教授和伦敦国王学院基因治疗和再生医学中心Lieberam 教授在《Advanced Materials》期刊上发表了题为” Biobased Elastomer Nanofibers Guide Light-controlled Human iPSC-derived Skeletal Myofibers”( DIO：10.1002/adma.202110441) 。为了解决这个问题，两个团队结合在生物高分子材料和干细胞技术的专长，合作开发了一种新型生物基高弹性纳米纤维生物材料支架和便捷灵敏的骨骼肌纤维培养多孔板盘， 利用光基因控制的人类诱导多功能干细胞（iPSC）在纳米纤维支架上衍生出更接近人体的骨骼肌纤维，证实了纳米纤维支架有助于实验室培养的骨骼肌组织的生长和稳定。
实验先设计合成了生物基聚氨酯弹性体，其纳米纤维是使用静电纺丝技术制成， 并通过附加电场来引导纳米纤维排列取向。 该纳米混杂弹性材料具有优异的高弹性，其断裂应变高达1000%，弹性模量（~25kPa）在人体骨骼肌的（~11-50kPa）模量范围内。 匹配的高弹性特性及像细胞外基质形貌的纳米纤维结构使其成为支撑肌纤维细胞生长和收缩的理想支架。肌纤维细胞是从人类iPSC干细胞分化衍生出来的。iPSC干细胞是一种由成人皮肤細胞经转入转录因子等技术脫分化形成的多能干细胞, 这类干细胞具有类似胚胎干细胞那样的再生能力，理论上可以分化为成体的所有器官和组织。 这些干细胞经过光基因工程处理， 使其分化衍生的肌纤维细胞对光响应。这使得我们能够通过光波信号控制肌纤维收缩，并在自制的悬浮弹性纳米纤维多孔板盘培养皿中研究肌肉收缩功能。实验结果证明，单轴排列取向的弹性纳米纤维能引导成肌纤维细胞定向生长， 促进和加强肌细胞纤维的生成。蓝光刺激时，弹性纳米纤维引导的骨骼肌纤维的收缩速度和收缩力分别高于是传统培养方法的200% 和280%， 其收缩能量密度为~35 W/m3 , 也在人体骨骼肌的收缩能量密度范围类。
弹性纳米纤维支架孔板盘适用于各种通用型和高通量的测试和图像分析表征方法， 可以同时进行大量样品试验。这将为肌肉和神经肌肉疾病建模，病理研究和治疗肌肉疾病的新药物筛选提供便捷的技术平台。另外，生物基聚氨酯弹性体具有很好的生物相容性和生物降解性，有望用于组织工程支架促进生成代替肌肉组织治疗骨骼肌损伤患者。
图1. (a) 电纺纳米纤维支架引导光基因控制的人类诱导多功能干细胞（iPSC）衍生骨骼肌纤维生长示意图；(b) 生物基聚氨酯弹性体分子结构
图2聚氨酯弹性体,P(EDS)UU-POSS, 纳米纤维的结构和性能。(a) EDS 多元醇、POSS 纳米结构、P(EDS)U-POSS 聚合物及其纳米纤维的红外光谱（FTIR）； (b) 随机取向和单轴取向的纳米纤维的偏振FTIR 光谱。红外线束在平行于（0°）和垂直于（90°）排列的纤维方向上进行偏振；(c) 随机取向和单轴排列的纳米纤维的扫描电子显微镜（ SEM）形貌图像；(d) 从SEM 图像测量的纳米纤维直径分布； (e) 快速傅里叶变换(FFT)分析 SEM 图像测量和拟合纤维取向分布；(f) 纳米纤维结构的高度和相位的原子力显微镜（ AFM）图像；(g) 和（h）随机和 取向的纳米纤维支架的拉伸断裂面SEM 图像。(i) 拉伸应力- 应变曲线；(j) 不同应变区的熵弹性模量；(k) 聚合物浇铸固体、随机取向和单轴对齐纳米纤维支架的拉伸强度、韧性和断裂应变。
图3. 肌纤维细胞在弹性纳米纤维支架上的形态和分化的荧光显微镜图像。蓝色代表细胞核DNA；绿色代表肌肉细胞中表达的F-肌动蛋白。C2C12 肌细胞在（a）玻璃盖玻片（对照）;（b）随机定向 和（c）单项排列的弹性纳米纤维上第 1、5 和 10 天的生长分化成肌管；(d) 快速傅里叶变换（FFT）分析肌纤维细胞和肌管的方向性。(e)和（f） 第 10 天肌管长度和宽度的频率分布。(g) 第 10 天肌管融合指数（MFI）和（h）肌管成熟指数（MMI）。比例尺100μm。
图 4. 单轴取向的悬浮纳米纤维支架（SNFs）的组装。(1) 直径 6.96 毫米的微孔从 2 毫米厚的涂有双面胶的亚克力板上切割下来。(2) 单个微孔被放置在两个带电的电极之间， 胶面朝上。对齐的纳米纤维被电纺在微孔上。(3) 微孔和纳米纤维悬浮在一侧，被倒置，并固定在一个 35 毫米的组织培养皿的底部。胶带的作用是将纳米纤维固定在微孔的边缘，同时允许将微孔固定在培养皿上。(4) 对组装好的微孔进行空气等离子体处理和紫外线消毒，以去除表面污染。(5) 在细胞播种前，用 GFR-Matrigel 预涂 SNFs。在浓缩的（30k 细胞/100ul）培养基中，将成肌祖细胞直接播种到中心孔中。5 分钟后，一旦细胞明显沉淀到孔底，就在组织培养皿中加入 1.5ml 的培养基。
图 5. 光基因控制人类 iPSC 衍生的肌纤维。(a) 第 0-21 天从人类iPSCs 到成肌细胞祖细胞诱导分化（progenitor differentiation [pd]，day 0pd-21pd ）；第0-8天从祖细胞到肌管分化（myotube differentiation [md]， day 0md-8md），以及第8-20天肌管成熟为肌纤维 (day 8md-20md)；(b) 表达 PAX7、MYOD1 和 MYOG 的成肌细胞祖细胞（day 21pd）和肌管（day 8md）的荧光（ICC）图像分析；(c) 第 10 天肌管（day 10md）纹状肉质Titin(TTN)的表达；(d) 第 10 天 肌管（day 10md）中转基因 ChR2-YFP 的表达。
图 6. 悬浮纳米纤维引导人类 iPSC 衍生的肌纤维的光遗传控制收缩。(a) 在组织培养（TC）塑料（对照）和悬浮纳米纤维支架（SNFs）上培养的人类 iPSC 衍生的肌纤维的显微镜白场图像；(b) 第 14 天培养物的 3D 和 2D 肌纤维细胞的 F-肌动蛋白和肌原蛋白（MYOG）免疫荧光图像；(c) 粒子图像测速仪（PIV）分析光遗传控制的收缩位移矢量图和收缩速度分布热图；(d) 第 20 天对照组和 纳米纤维支架上的肌纤维收缩的PIV 视频中得到的肌纤维收缩速度（CV）轨迹。图中的蓝色区域表示 470nm 光开启的 0.5s 时间窗口。平均值±标准偏差；(e) 第 8 天到第 20 天的对照组和 取向纳米纤维支架上的肌纤维的面积平均收缩速度(μm/s)；（f）比收缩力（kN/m2 ) 和 (g) 能量密度（ W m-3 )；(h) 第 20 天的 收缩速度和比收缩力相对于对照组的百分比差异；(i) SNFs 上培养的肌纤维的扫描电子显微镜（ SEM）图像。
论文第一作者是博士生 Aimee Cheesbrough。通讯作者为宋文辉教授和Lieberam 教授。此研究得到BBSRC 伦敦跨学科博士 ( LIDo )培训计划， EPSRC和 MRC基金及 Wellcome Trust慈善基金等支持。
原文链接：https://doi.org/10.1002/adma.202110441
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