赵健 刘昌胜
（华东理工大学 教育部医用生物材料工程研究中心，上海，200237）

摘要
       介绍了W/O/W复乳液法制备血红蛋白纳米微囊，包封率在72%~88%；所制纳米微囊的粒径分布在要求的70~200nm的范围内，形态规则，大多呈球形；zeta电位表明这种纳米微囊表面带有一定的负电荷，这使粒子不易聚集，对粒子的稳定性有利；另外XRD图谱表明PCL对血红蛋白的包埋是有效的。这将为血红蛋白纳米微囊作为人造红细胞提供一种有效的制备手段。

        人血液代用品系指人红细胞代用品，尤其是以血红蛋白为基质的纳米微囊血液代用品模拟天然红细胞膜和红细胞内的生物环境，用仿生的原理将高分子材料作为壳材料，内部包埋血红蛋白，制备成为“人工红细胞”，是目前研究最活跃、同时应用领域最广泛的一类血液代用品。在构建体内长循环纳米粒时较好的粒径范围为70~200 nm。纳米微囊的形态、粒径、粒径分布、表面性质、包封率等是影响其体内分布与稳定性的主要因素。本文将介绍血红蛋白的可生物降解聚合物纳米微囊的制备以及关于纳米微囊的表征。

实验方法:
(1)制备 采用复乳液溶剂挥发法制备血红蛋白的可生物降解聚合物纳米微囊。首先将血红蛋白溶解，配制成内水相加入到5%的PCL的二氯甲烷溶液中，经超声或高速匀浆乳化成W/O的初乳液，然后顺次加入到外水相和分散相中，得W/O/W复乳液，在常温常压下连续搅拌，使溶剂完全挥发，制得血红蛋白纳米微囊的混悬液。空白微囊制备过程除无血红蛋白，其余同上。混悬液经10 000 rpm离心1 hr，沉淀微囊、顺次洗涤、冻干贮存备用。
（2）表征 包封率的测定，取混悬液经10 000 rpm离心1 hr后的上清液，用分光光度计法测其中血红蛋白含量W1，设总透料血红蛋白的量为W，则包封率的表达式如下：包封率EE%= W1/W（%）；粒径及其分布的测定，取血红蛋白纳米微囊的混悬液适量，加双蒸水稀释后，用激光粒度分析仪测定体积平均粒径，多分散度；zeta 电位测定，取血红蛋白纳米微囊的混悬液适量，分散在 pH不同的缓冲溶液中，用zeta电位仪测定纳米微囊的zeta 电位；扫描电镜观察，血红蛋白纳米微囊经沉淀、洗涤、冻干后，固定于采样台上，在纳米微囊表面喷金，然后置于扫描电子显微镜下观察纳米粒子的形态；X-射线衍射，采用Rigaku D/max2550 VB/PC。实验条件为：功率40 kV,100 mA，铜靶，3500 CPS。

数据结果：血红蛋白纳米微囊的粒径及其分布如图1所示。从粒径分布图上可以看出，只有一个粒径分布峰，血红蛋白微囊的粒径分布在80~200 nm之间，且分布较窄，大部分粒径集中在100~160 nm的范围内；SEM观察结果表明，血红蛋白纳米微囊大多呈球形，表面圆整；Zeta电位测定结果表明血红蛋白纳米微囊在pH大于４时带有较强的负电荷，这使纳米粒之间由于同种电荷的相互排斥作用而不易聚集，从图上可以看出，pH越大，zeta电位的绝对值越大，也表明越大，对纳米混悬液的稳定性越有利。而在体内血液循环的过程中，微弱的pH变化将不会影响血红蛋白纳米微囊的稳定性；血红蛋白、血红蛋白同空白微囊的物理混合物以及包埋血红蛋白的毫微胶囊等3个样品的XRD图谱见图4。血红蛋白及其同空白微囊的物理混合物的XRD图谱均呈现非晶态衍射的散漫的“晕环”，而在蛋白微囊的图谱上这种非晶态的特征不再出现，取而代之的是21.44°、27.439°、31.760°、45.52°和56.56°等共12个特征峰，即有确定 d值的锐衍射峰，这是PCL具有一定结晶性的特征，表明毫微胶囊中的血红蛋白被包覆于壳材料之中；经测定包封率在72%~88%，说明此方法对血红蛋白的包埋效率较好。

主要论点和结论：本文对复乳液法制备血红蛋白纳米微囊进行了简要介绍，并对相关指标进行了测试，得如下结论：所制纳米微囊的粒径分布在要求的70~200 nm的范围内，形态规则，大多呈球形，zeta电位表明这种纳米微囊表面带有一定的负电荷，这使粒子不易聚集，对粒子的稳定性有利。另外XRD图谱表明PCL对血红蛋白的包埋是有效的。这将为血红蛋白纳米微囊作为人造红细胞提供一种有效的制备手段。