程忠玲1,2，王松1，朱鹤孙1
(1. 北京理工大学材料科学研究中心，北京100081；2. 承德石油高等专科学校化工系，河北承德067000)
Preparation and blood anticoagulant activity of heparinized collagen/silk fibroin blend film
CHENG Zhong-ling1,2, WANG Song1，ZHU He-sun1
(1. Research Center of Material Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;
2. Department of Chemical Engineering, Chengde Petroleum College, Chengde 067000, china)

Abstract：The blend film was prepared by blending the heparinized collagen and aqueous of silk fibroin, and glutaraldehyde was used as a coupling agent in order to enhance its mechanical properties of blend film. The blend film in vitro blood anticogulant activity was assessed by activated partial thromboplastin time (APTT), activated thromboplastin time (PT), thrombin time (TT) measurement. The combination rate approached the optimum of 56% and the rupture strength was 45MPa as glutaraldehyde mass concentration was 5g/L.Experiments were done to determine APTT, TT, PT. APTT, TT, PT of blend film was excess 150, 200 and 50s respectively.
Key words：collagen；silk fibroin；heparinize；anticoagulant activity
摘要：将肝素化胶原与丝素溶液共混，制备了肝素化胶原/丝素共混膜，并采用戊二醛作为交联剂，以提高共混膜的机械性能。共混物的体外抗凝血活性采用部分凝血活酶时间(APTT)、凝血活酶时间(PT)、凝血酶时间(TT)来评价。当戊二醛的质量浓度为5g/L时，肝素的结合率为56%，共混膜的断裂强度为45MPa。APTT、TT、PT凝血时间实验证明，共混膜的APTT、TT、PT分别超过150、200和50s。
关键词：胶原；丝素；肝素化；抗凝血性
中图分类号：O636.9         文献标识码：A
文章编号：1001-9731（2004）增刊-2484-03

1 引言
         利用肝素化来提高材料的抗凝血性研究始于20世纪60年代。最先通过离子键使材料表面肝素化的途径是Gott提出的GBH方法,而近年来采用离子键固定肝素主要是利用大分子主链或侧链季胺化再肝素化的方法。本文选用酶法制备的胶原作为固定肝素的载体，是因为胶原是一种天然生物材料，生物相容性好，在酸性条件下胶原中带正电的氨基基团可与肝素中带负电的硫酸基团相互作用，以离子键结合形成肝素化胶原复合物[1]。为解决酶法制备的胶原存在机械性能差，溶涨性大的弱点，在肝素化胶原中加入另一种成膜性较好的天然纤维蛋白质——丝素蛋白，以解决肝素化胶原的溶涨问题，并加入戊二醛（GA）为共混膜的交联剂，GA可与蛋白质形成交联结构，蛋白质之间通过稳定的碳氮共价键的搭桥而紧密结合在一起，其稳定性和力学性能大大提高[2]。体外抗凝血实验APTT、TT、PT表明，该共混膜具有良好的抗凝血性能，从而得到一种性能优良的新型生物医用复合膜。
2 实验
2.1 丝素蛋白溶液的制备
         蚕丝用0.5%NaCO3水溶液煮沸30min,精练2次，精炼后用蒸馏水充分洗净，自然干燥得到脱胶丝素纤维。然后用氯化钙∶乙醇∶水=1∶2∶8（摩尔比）的溶剂在80℃下溶解丝素纤维。将溶解得到的丝素溶液倒入纤维素透析膜中，分别在水、蒸馏水中透析72 h，滤去杂质，得丝素水溶液。用紫外吸收法测定浓度。
2.2 肝素化胶原的制备
         猪皮在0.5g/L的NaOH溶液中浸泡过夜，脱脂后在pH=3条件下，用适量的胃蛋白酶和青霉素酶解4d，当降解物成胶状后，用0.5g/L的NaOH溶液调至pH=10，并放置于4℃冰箱中使胃蛋白酶失活。然后采用等电点沉淀法调节pH=6~7使胶原沉淀，冷冻离心分离、纯化，然后在0.1g/L的醋酸溶液和蒸馏水中分别透析3d，冷冻干燥得胶原。将50mg胶原在0.2g/L的醋酸溶液5mL中于50℃溶解后，向其内滴加10g/L的肝素溶液0.5mL，均匀搅拌10min,得到肝素化胶原。结构表征采用EQINOX55型红外光谱仪进行红外扫描。
2.3 肝素化胶原/丝素共混膜的制备
         将肝素化胶原与丝素溶液共混（胶原/丝素的质量比为1/4），加入戊二醛作交联剂，混合并缓慢搅拌，静置脱泡，注入聚乙烯模具内，在25℃、相对湿度为65%的环境下干燥72h成膜。
2.4 肝素结合率的测定[3]
2.4.1 肝素标准曲线的绘制
         将25mg甲苯胺蓝溶于500ml含有0.49ml的37%HCl和1g NaCl的去离子水中，得到0.05g/L的甲苯胺蓝溶液。用进样器量取3ml已知浓度的肝素水溶液于试管中，加入3ml甲苯胺蓝溶液，充分振荡混匀，然后加入3ml正己烷后振荡混合使其分相，读取下层水相在631nm处的吸光度，以肝素含量（μg）为x轴，631nm吸光度为y轴，绘制标准曲线。
2.4.2 肝素结合率的测定
         将肝素化的共混膜浸入15ml水中，5天测试一次浸泡液中肝素的溶出量，方法为量取3ml已定容的浸泡液于试管中，其它试剂的加入同1.5.1方法，测其吸光度，对照标准曲线，读出相应肝素的量，直至浸泡液中的肝素溶出量为零。按结合在共混膜中的肝素量来计算肝素结合率。
2.5 膜的机械性能测定
         将膜裁成10mm×60mm的样条，用TOM500J型万能引张压缩机测定膜的拉伸强度,拉伸速度100mm/min,负载5㎏，每组3个样品，取其平均值。
2.6 体外抗凝血活性评价
         体外抗凝血活性评价，采用体外凝血时间试验，包括APTT、TT、PT 3种凝血时间测定。将试样置于比色杯中，在健康人血浆中温育一定时间，加入测定APTT、TT、PT所需的各种酶反应试剂，引发血栓的形成。APTT、TT、PT3种凝血时间测定采用COAG-A-MATE-XM型半自动四通道凝血仪，按使用说明测定。
3 实验结果与分析
3.1 肝素化胶原/的形成
         胶原是由三股α-肽链相互拧成的纤维状蛋白质，胶原蛋白分子是由多肽链作螺状缠绕而成的绳索状大分子，每条多肽链约含1030个氨基酸残基，由于氨基酸中含有酸性的羧基和碱性的氨基,羧基可以把质子转移到碱性的氨基上，在同一分子上产生一个正电荷和一个负电荷，使氨基酸成为偶极离子，常常以两性离子的形式（－NH3+ 和COO - ）存在[4]。肝素（a）、复合物（b）、胶原（c）的红外光谱见图1。从复合物的红外光谱图1（b）中可以看出，1652（酰胺I）、1538（酰胺II）、1240（酰胺III）和565cm-1（酰胺V）是胶原相应酰胺的特征峰，在850cm-1处出现新峰，为复合物的硫酸基团C－O－S伸缩振动峰，由于肝素的硫酸基与胶原中带正电氨基形成了离子键，使其从820 cm-1（肝素的硫酸基位置）移到了850 cm-1。
3.2 肝素的结合率
3.2.1 肝素的标准曲线
         采用甲苯胺蓝染色法测定肝素的含量。肝素可以与甲苯胺蓝形成复合物而使溶液中甲苯胺蓝含量有所下降，加入非极性有机溶剂如正己烷进行抽提，将肝素-甲苯胺蓝复合物抽提到有机相中。通过检测溶液在一定波长（甲苯胺蓝的特征吸收波长通常为631nm）处吸光度的下降便可求得所测肝素量。图2为肝素在631nm处的标准曲线。

3.2.2 戊二醛质量浓度对共混膜的肝素结合率的影响
         戊二醛质量浓度对共混膜的肝素结合率的影响，结果见图3。未用戊二醛交联的肝素化胶原/丝素共混膜的肝素结合率为32%，加入戊二醛后，肝素结合率随戊二醛的质量浓度增加而增加，当戊二醛的质量浓度增加到5g/L时，肝素结合率达到56%，以后随着戊二醛用量的进一步增加，稍微出现下降的趋势。

         正常人血的凝血时间分别为：PT：(11±3)s；APTT：(28±10)s；TT：(16±5)s。表2数据表明，所采集的血浆样品的凝血时间在正常范围之内。通过测定胶原/丝素膜与血浆接触后的凝血时间可以看出，未经肝素化处理的丝素/胶原膜的凝血时间与空白血浆的凝血时间相比变化不大。而经肝素化后的胶原/丝素膜表现出优异的抗凝血性能，3种凝血时间APTT、TT、PT都超出了仪器的设定范围，表明固定在胶原/丝素膜中的肝素仍保持良好的生物活性，有效地提高材料的抗凝血性。
4 结论
         将肝素化胶原与丝素共混，以戊二醛为交联剂，制备的共混膜中肝素的结合率及其机械强度与交联剂的质量浓度有关，当戊二醛的质量浓度为5g/L时，共混膜的肝素结合率为56%，断裂强度为45MPa，凝血时间APTT、TT、PT分别超过150、200和50s。

参考文献：
[1] 朱鹤孙. 医用与口腔材料. [M]. 北京: 科学出版社, 1999, 5.
[2] 李天全. [J]. 生物医学工程杂志, 1998, 5(2): 118-124.
[3] Ducan AC, Boughner D, Campbell G. [J]. European Polymer Journal, 2001, 37: 1821-1826.
[4] 胡建芳, 钱露西, 郭淑静, 等. [J].材料研究学报, 1994, 8(1): 82-87.

基金项目：国家重点基础研究（973）计划项目（G1999064705）
作者简介：程忠玲（1969—），女，山东荣成人，讲师，承德石油高等专科学校教师，主要从事抗凝血材料的研究。（E-mail: czl1969.student@sina.com），Tel: 010-68949661。

论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日