冯波，翁杰，屈树新
（西南交通大学材料科学与工程学院，四川成都610031）
Surface biological modification for bone substitute materials: a review
FENG Bo, WENG Jie, QU Shu-xin
(School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)

Abstract：This paper reviews the current trend of surface biological modification for bone substitute implants. Section 1. gives an introduction. Section 2. presents that biological molecules, proteins and growth factors adsorb or bond onto surfaces of materials. Section 3. includes application of self-assembly monolayers and micropattern in surface modification of biomaterials.
Key words：bone substitute materials；biological modification；natural organic molecule；protein；self-assembly；micropattern
摘要：评述了近年对骨植入材料进行表面生物化改性的研究进展。第一部分是简要的概述。第二部分涉及通过物理吸附或化学作用使黏附性蛋白、生物活性肽、生长因子和某些生物分子等结合到骨生物材料表面，以及这些蛋白质与钙磷共同结合到材料表面。第三部分综述了自组装单层（SAMs）和微模型化（Micropattern）技术在骨生物材料表面改性方面的研究现状。
关键词：骨替换材料；生物化改性；天然有机分子；蛋白质；自组装；微模型化
中图分类号：TQ174;TB33 文献标识码：A
文章编号：1001-9731（2004）增刊-2321-04

1 引言
         骨生物材料主要包括关节替换材料和牙种植材料。理想的骨替换材料应当具备优良的生物活性和适宜的机械性能，以便与骨组织形成化学键合。并且有足够的负载能力、耐磨损和耐腐蚀等性能。负荷承载能力与材料的体性能和植入器械的结构设计等有关。生物活性、耐磨损和耐腐蚀能力则主要取决于材料的表面性能。然而，通常的生物材料很难同时兼具良好的体性能和表面性能。如金属材料虽承载能力强，但通常呈生物惰性，难以与骨组织形成化学键合，也不能避免磨损和腐蚀的问题。尽管一些生物陶瓷，如羟基磷灰石(HA)、生物玻璃陶瓷和硅灰石等具有优异的生物活性，但存在脆性大和耐磨性差的缺陷。高分子材料有着金属和陶瓷不可比拟的柔韧性，然而往往不具备生物活性，且易磨损。因此，除通过多种成分结合，制备性能互补的复合材料外，利用表面技术改善材料表面生物学性能成为当今骨生物材料研制的一个重要发展方向。
         对于骨生物材料的表面改性，主要目的之一是改善植入材料与骨组织形成化学键合的能力。这种键合使材料与组织产生牢固的骨性结合（Bone-bonding），而不是被纤维组织所分隔。通常认为，界面类骨羟基磷灰石（Bone-like hydroxyapatite，BLHA）的形成是骨键合的必要条件，因为BLHA能够吸附骨生长因子等蛋白质，引导骨细胞在其表面生长，促进骨组织的修复与重建。迄今在通过表面活化改性，使材料表面具有形成BLHA的能力方面，已经提出多种方法，做了大量研究。而另一方面，由于生物材料植入体内后，首先是蛋白质吸附到表面，与材料表面相互作用。随后，已受到蛋白质调制的表面再与细胞作用，发生细胞黏附，分化与生长。因此，通过生物化学改性，在材料表面引入能促进骨生长的蛋白质或某些生物分子成为表面生物活化改性的另一途径。近年开始受到关注。有时也涉及将生物有机成分与生物无机成分，如Ca和P等同时结合到材料表面。总之，骨生物材料的表面改性就是要在材料表面构建骨组织的生理或仿生微环境。2 吸附与共价结合[1~10]
         与骨生长相关的蛋白质主要有黏附性蛋白、生物活性肽和生长因子等几类。黏附性蛋白包括胶原、纤维粘连蛋白（Fibronectin，FN）、玻璃粘连蛋白（Vitronectin，VN）和层粘连蛋白（Laminin，LN），生长因子包括骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein, BMP）和转移生长因子（Transforming growth factor），生物活性肽包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（Arginine-glycine-aspartic acid, RGD）这一许多细胞外基质蛋白(如VN、FN和胶原等)的最小识别顺序，以及赖氨酸–精氨酸–丝氨酸–精氨酸（Lysine-arginine- serine-arginine，KRSR）。可利用化学或生物化学手段将这些生物分子或酶等固定到材料表面或在表面制作蛋白质涂层，使骨生物材料表面活性化。
         虽然磷酸钙陶瓷，尤其是HA具有优良的生物活性，但是，合成HA与骨组织中天然HA仍然存在明显差异。一方面，合成HA通常不含Mg、K、F和CO32− 等无机成分；另一方面，骨骼中HA是与胶原和蛋白质等有机成分有序组合排列。此外，在体内，合成HA 表面层转化为BLHA往往需要较长的诱导期。因此为了进一步改善生物活性，有时也对磷酸钙陶瓷进行表面改性。白蛋白是体液中一种含量丰富的蛋白质，易于与多肽共价结合，从而促进细胞在植入材料表面的吸附与生长。血清白蛋白能化学吸附到HA表面，形成血清白蛋白-HA复合物，改变了Ca/P比例。富含酸性氨基酸，如谷氨酸（Glutamic acid）的仿生肽谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苏氨酸（Glutamic acid-Prolin-arginine-glycine-aspartic acid –threonine）通过其羟基与HA中的钙结合，化学吸附到羟基磷灰石表面，能够促进成骨细胞的附着与扩展。用三羟甲基氨基甲烷电解缓冲液进行磷酸钙表面层修饰，并吸附血清蛋白后，能明显促进造骨细胞的吸附与分化。
         对于钛的表面活化改性，当添加BSA到过饱和钙磷溶液中，BSA对HA层的形成有一定抑制作用，但是BSA能与Ca-P共沉积到钛表面。并且，BSA能结合到HA晶格中，而不是吸附在表面。同时，还能促进磷酸钙的晶型转变，如使磷酸八钙转化为HA。对于涂层的机械强度也有改善。如划痕试验表明，当BSA浓度在10~1.0mg/ml范围时，涂层机械强度随浓度线性增加。
FN和VN是多糖蛋白，具有黏附细胞，包括成骨细胞的能力，对骨形成有着重要作用。Kothari等将VN固定到钛表面,利用Westernblotting 法测多克隆抗体数量，包括FN和纤维蛋白原，以白蛋白Ab为对照。发现固定有VN的骨结合界面上存在更多的蛋白。而且，由于整合素(Integrin)中VN的受体αv和β3与成骨细胞间的相互识别，促进了成骨细胞附着和骨基质粘附与生长。但是，当用Hanks平衡盐溶液（HBSS）活化处理钛时，无论是表面预涂FN后再浸入HBSS，还是浸入FN+HBSS，均发现FN对Ca-P层的形成有一定抑制作用。而且，当FN浓度增加到0.05mg/ml，尽管还远低于生理溶液中的浓度，如血液中为0.2mg/ml，就已经显示出较强的抑制作用。I 型胶原是骨中的主要有机成分，以I 型胶原涂覆钛后，大幅度地提高了角质形成细胞和成骨细胞的附着能力，尤其是对于细胞的初期黏附。LN也是参与骨形成的一种蛋白质。钛表面涂覆LN后，明显改善了角质细胞形成和胶原矿化用。
         表面有RGD肽涂层时，增强了成骨细胞的附着能力。体内试验也表明以肽序列改性钛后，促进了新骨生长。在钛表面沉积与肽有强附着力的金后，浸泡于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半光氨酸（RGDC）肽的乙醇和水溶液，室温过夜使肽吸附到材料表面。植入兔股骨2周后，发现有肽涂层的试样周围，新骨厚度更大，4周后新骨明显增多，而无肽试样几乎没有变化。前者的拔出强度亦高于后者。用溶胶－凝胶法在钛表面制备氨基酸涂层则不需加入中间层。以碱溶液预处理钛后，用赖氨酸和四乙氧基钛溶于乙醇溶液制成溶胶，利用浸涂方法就可得到含氨基酸的涂层。
         BMP序列中，人基因重组产物BMP-2，BMP-4，rhBMP-2，rhBMP-4具有优良的生物活性，能够促进体内新骨在原位和异位生长。Puleoa 等用体外试验研究了表面含BMP-4的Ti6Al4V对成骨细胞活性的影响。通过赖氨酸的等离子体聚合，在Ti6Al4V表面引入氨基，将氨基量控制在5～12NH2/nm2之间。然后用以固定溶霉菌和BMP-4。以简单吸附作为对照。固定程序分为两种，一步法是直接将氨化的钛浸泡于蛋白质溶液，两步法是用丁二酸酐将氨基转化为羧基后，再置于蛋白质溶液中。这两种固定程序都能控制蛋白质的结合量，但是一步法引起的交联使溶霉菌失去活性。用鼠成骨细胞株培养试验表明，简单吸附和两步法固定BMP-4试样均显示出较高碱性磷酸酶活性，前者还高于后者。如果当细胞培养前在生理溶液中预孵化，以除去弱吸附的蛋白质后，再进行细胞培养，虽然两者的碱性磷酸酶活性都有降低，但是，固定BMP-4的钛试样较吸附试样有更高碱性磷酸酶活性。说明化学固定蛋白质对于钛表面改性有更好的活化效果。在筒状钛丝网植入体表面吸附以聚乳酸-聚乙烯乙二醇共聚物为载体的rhBMP-2后，植入兔肱骨上预留的缺损部位。6周以后植入体表面新骨生成，并与断骨连接。新骨也长入植入体的空隙中。缺损被修复的程度与植入体表面rhBMP-2含量有关。
         磷是HA中的一个重要成分，并且二磷脂类化合物对骨羟基磷灰石有高亲合性，具有防止成骨细胞吸收及骨吸收的功能。因此，以含磷化合物改性钛表面也是一个有效途径。但是简单地用磷酸浸泡处理，虽然钛表面的复合磷化物和表面羟基及微孔结构也能使钛表面在一定程度上生物活性化，诱导HA在钛表面自发生长。但是其效果远较Ca(OH)2 预处理法为差。已经发现天然磷脂类（PL）与钙磷的复合物PL-Ca-P复合物具有诱导磷酸钙沉积的作用。Arpan Satsangia 等以磷脂酰胆碱（Phosphatidycholine）、磷脂酰肌醇（Pphosphatidyl-serine, PS）和磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylinositol）涂覆于钛表面，再与Ca-P溶液作用，形成Ca- PL –P复合物表面层。成骨细胞培养试验显示，Ca-PS –P/Ti 表面蛋白质合成量和细胞的碱性磷酸酶活性高于未改性钛，并且置于SBF浸泡后，Ca-PS–P/Ti表面矿化层最为明显，而未改性钛表面没有矿化发生。这表明用Ca-PS –P对钛表面改性可能有助于钛表面的骨生长。
3 自组装和微模型化[11~24]
         自组装（SAMs）是自然界的重要现象，通过自组装形成各种高度有序、具有特定功能的结构。如核酸中的基因信息储存、太阳能转化为生物化学能、蛋白质组织为有效的分子机构、HA与胶原等自组装为骨组织等。20世纪80年代后期，Whitesides 和Porter等报道了长链烷基硫醇（HS(CH2)n, n ≥ 10, X = 功能基）能从溶液中吸附到金表面，形成密集排列，并有序取向的单层，即自组装单层（Self-assembled monolayers）。硫强烈地吸附到金表面。X端基位于液-单层界面。在生物医学工程中，SAMs 技术被用于研究生物系统内信息的储存、复制与传递等，研制生物传感器和药物缓释系统等。在骨生物材料方面，SAMs作为一种模型系统，在材料表面建立一些特殊位点，既可用于研究细胞或蛋白质在这种模板化表面的行为，及其与特殊位点的成分、性能和结构等的关系，也用作诱导HA形成的生物模板。
         表面微模型化（Micropattern）技术近年正在成为研究细胞-材料界面作用和活化改性骨生物材料的新方法。使材料表面化学物质微模型化，固定对骨生长具有活性的蛋白质或肽，促进和引导特定的细胞附着到材料表面，以增强细胞与材料表面的相互作用。为了避免某些非特异性细胞黏附到表面。也可以印制阻碍该细胞黏附的蛋白质或肽。简单的微模型化技术有微书写（Micro-writing）、微加工（Micro-process）和微印制（Micro-imprint）等。其中，微印制技术也称为微接触印制（Micro-contact print），以其简单和低成本而显示出很好的应用前景。微印制技术的一般程序是：先以树脂（如甲基丙烯酸甲酯，PMMA）溶液涂覆到某种基材上，固化后用光刻技术（Photolithographic）或其他方法刻蚀树脂，得到含有需复制花样（Pattern）的掩模（Mask）；然后将另一种树脂覆盖到掩模上并固化；分离树脂与掩模，得到与掩模阴阳相反的模板，即印章（Stamp）；在印章表面涂覆蛋白质溶液或SAMs的成膜溶液，将溶液印制到另一底材上，按印章花样在不同区域形成蛋白质层或SAMs；无蛋白质层或SAMs的区域可再通过吸附或化学反应制备其他膜。这样就按印章得到模型化的蛋白质层或SAMs，也称为模板。各区域的大小、化学成分和分子结构等都对蛋白质和细胞与表面的作用有影响。
         M.E. Hasenbeina等用微接触印制方法研究了表面不同大小的圆形区域及在其上固定的肽对成骨细胞附着的影响。首先用光刻法制备印章，使印章表面分布着多个由亲水化合物3-三乙氧基硅丙基-二乙烯三胺(3-(trimethoxysilyl)propyl)-diethylenetriamine，DETA) 覆盖的圆形区域，不同印章表面圆形区域的直径分别为10、50、100或200µm。各圆形之间的间隔均为10µm，被憎水化合物八癸烷三氯硅烷（Octadecyltrichlorosilane(OTS)）所覆盖。再用微接触印制技术将印章上的花样转印到盖玻片上。DETA区域进一步以不同的肽（如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（Arginine-glycine-aspartic acid-serine，RGDS）； 精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-丝氨酸（Arginine- aspartic acid-glycine-serine，RDGS）；赖氨酸-丝氨酸-丝氨酸-精氨酸（Lysine-serin-serine- arginine，KSSR）或KRSR）进行表面改性。然后作成骨细胞和成纤维细胞培养试验。4h之后，在含有非黏附肽RDGS和KSSR的圆形区，成骨细胞或成纤维细胞极少附着，随机分布。而在黏附性肽RGDS改性的圆形区，成骨细胞和成纤维细胞均附着并成族状。另一种黏附性肽KRSR具有选择性促进成骨细胞附着的能力，在KRSR改性的圆形区，仅成骨细胞附着，形成族状。这说明某些肽的模型化区域能够引导特定的细胞株附着。如在微模型化表面，固定有KRSR的区域能择优黏附成骨细胞，而不是成纤维细胞。模型尺寸对细胞黏附有影响，如圆形小于成骨细胞尺寸时，不宜于成骨细胞黏附。在用光刻法制得的印章表面倾倒角质蛋白溶液，待充分反应后，除区未组装的角质蛋白，可得到含自组装角质蛋白网络的印章。角质蛋白是牙骨中细胞外基质蛋白，对牙种植体表面的骨生长有促进作用。
4 结语
         生物化学表面改性思想是以人体组织中的生物分子与植入材料的相互作用为基础，为骨生物材料的表面活化研究提出了一个新方向，也初步获得了一些有益的启示。但是在生理环境，尤其是骨组织环境，并不是仅仅存在有机分子，而常是有机成分与无机成分以特定方式结合共存。因此，在骨生物材料表面构建极为接近天然状态的结构，始终是研究者的努力方向，目前，这一距离正在缩短。

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基金项目：国家自然科学基金资助项目（30370408）
作者简介：冯波(1957－)，男，四川南充人，博士，教授，西南交通大学材料科学与工程学院。研究领域为生物医用材料。（E-mail:fengbh@163.com; Tel:028-87634023）

论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日