李哲怡1, 魏爱香3，潘仕荣2，陈弟虎1
(1. 中山大学理工学院光电材料与技术国家重点实验室, 广东广州510275；2. 中山大学附属一院人工心脏研究室，广东广州510080；3. 广东工业大学材料与能源学院，广东广州510643)
Microstructure and blood compatibility of amorphous hydrogenate carbon biological coating
LI Zhe-yi1, WEI Ai-xiang3, PAN Shi-rong2, CHEN Di-hu1
(1. Physics and Engineering Department，Sun Yet-sen University，Guangzhou 510275, China;
2. Artificial Hart Lab. The 1st Affiliate Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China;
3. Faculty Materials & Energy, Guangdong University Technology, Guangzhou 510643, China)
Abstract：In this paper, tetrahedral amorphous hydrogenated carbon (ta-C:H) films are prepared with various substrate bias voltages by magnetic filter plasma stream deposition system. The microstructures and optical band gap of the samples are studied using ultraviolet-visible absorption spectra. The blood compatibility of the samples is evaluated using in vitro platelet adhesion investigation, and are compared with that of references samples, one is the best material in blood compatibility used in clinical application (Chrono flex), another is the worst material (Glass). The quantity and morphology of the adherent platelets on the surface of these samples are investigated employing scanning electron microscopy (SEM). It is believed that substrate bias voltage has an effect on sp3 content and blood compatibility of ta-C:H films. The sample prepared at a substrate bias voltage of –20V shows the best blood compatibility in this work.
Key words：ta-C:H film；absorption spectra；blood compatibility
摘要：通过磁过滤等离子沉积技术，在不同衬底负偏电压下（0～－80V）制备四配位氢化非晶碳薄膜（ta-C:H），通过紫外－可见吸收光谱（UV）测定薄膜的微结构和光学带隙。通过血小板粘附实验研究了不同微结构ta-C:H薄膜的抗凝血性能，在扫描电镜（SEM）下观察血小板形态、聚积变形等情况，统计血小板粘附数量。并以美国PolyMedica公司生产的、临床应用最好的抗凝血生物材料“聚碳酸酯聚胺酯（Phrono flex）”作阴性对照，以最差的玻璃作阳性对照进行对比实验。实验结果表明：在不同的负衬底偏压条件下制备的a-C:H薄膜，其sp3含量不同，抗凝血性能也不同。在衬底负偏电压为－20V下制备的ta-C:H薄膜，具有优良的抗凝血液性能。
关键词：ta-C:H薄膜；吸收光谱；血液相容性
中图分类号：R318.08 文献标识码：A
文章编号：1001-9731（2004）增刊
1 引言
随着人们生活水平的提高和医疗技术的进步，人造器官和矫形植入体已被广泛应用于临床医疗中，如人工关节、人造骨、人工心脏瓣膜、血管胃管支架等。这些植入体大多数由钛合金（Ti6Al4V）、高聚合物或热解碳等制成。由于该类材料生物相容性能的欠缺，当它们与血液或体液接触时将产生一系列生化反应，导致血小板粘附形成血栓，或引发致敏、毒性、炎症等生物反应，在体内产生生理负作用[1]。因此，生物相容性材料的合成以及人造器官或矫形植入体的表面改性是生物医用材料研究的重要领域之一。作为人体植入体的生物医用材料，除了具备良好的化学稳定性、生物稳定性和机械性能外，还必须满足血液相容性和组织相容性。金属及其合金（如TiNi和Ti6Al4V）由于具有良好的机械性能和较好的生物相容性被广泛用作植入体材料，如心脏瓣膜和心血管支架、膝盖骨以及其他矫正植入体等。但由于镍和钛离子释放到体液中会引起毒性反应，与血液接触还有一定的致血栓性，因此，对金属及其合金进行表面改性是国内外提高植入体生物相容性能的主要研究方向。西南交通大学黄楠教授采用等离子体浸没离子注入表面改性技术（PIII），在心脏瓣膜与血管支架材料表面沉积Ti-O薄膜进行改性，其血液相容性大幅度提高[2]；上海冶金所离子束实验室[3]采用离子束增强沉积技术在热解碳基体上沉积TiO2薄膜，动物体内、体外实验证实改性后其血液相容性比热解碳更好。大连理工大学刘敬肖教授等[4]采用离子束增强沉积技术，在NiTi基体上沉积TiO2和Ti-Ta-O薄膜后，抗模拟体液腐蚀性提高，凝血时间延长。碳是人体中最为丰富的组成成份之一，碳素涂层薄膜对人体无毒性反应，具有良好的生物相容性、化学惰性和低摩擦、高硬度等优良的特性，被认为是金属及其合金生物医用材料表面改性的首选材料。Mitura等[5]采用射频等离子体化学气相沉积技术(RF-PCVD)在AlSi-316L不锈钢基体上沉积纳米金刚石薄膜，对其在模拟体液中的抗腐蚀性、化学稳定性以及在动物体内的毒性反应和过敏反应等进行了研究。Krishnan [6]和Gutensohn [7]研究了类金刚石薄膜(DLC)的血小板粘附和生物相容性，表明DLC表面上血小板粘附量减少，而生物相容性明显提高，但DLC膜在界面的剪切应力对血小板粘附量有较大的影响。
本文采用多弧磁过滤真空溅射离子技术制备四配位氢化非晶碳薄膜(Tetrahedral amorphous carbon, 简写ta-C:H)，该薄膜的最大特点是薄膜中sp3键的含量（sp3/sp3+sp2）可随工艺条件不同而进行调节，其性质类似于金刚石薄膜或类金刚石薄膜。在不同的衬底负偏电压下，制备出不同微结构特性的ta-C:H薄膜，通过紫外-可见吸收光谱、血小板粘附等实验对ta-C:H薄膜的微结构特性和抗凝血性能进行了研究。
2 实验
2.1 样品制备
采用磁过滤真空等离子体沉积系统，在不同的衬底负偏电压下制备ta-C:H薄膜样品。以单晶Si(100)、石英为衬底，衬底温度为室温。如图1所示为系统原理图，在自制的直流辉光等离子体放电的离子源中，引入高纯反应气体甲烷（CH4）和稀释气体氩气（Ar），在工作气压为7Pa，辉光放电电压为1.6Kv，形成直流辉光等离子体。等离子体经过90°弯曲的螺线管磁场过滤，通过在衬底与阳极之间施加衬底偏压Vb，改变入射到衬底上C+ 离子的能量，控制沉积薄膜的微结构。在衬底偏压Vb为0～－80V范围内，过滤磁场为40mT的条件下，制备了一系列sp3成分不同的ta-C:H 薄膜。平均沉积速率约为5nm/min.。
2.2 紫外-可见吸收光谱的测量
待测样品是沉积了ta-C:H膜的石英片，使用UV-240型紫外-可见光双光束分光光度计，在190～700nm范围内进行测量。测量时，取一片纯净的石英片作参考，以消除衬底的影响。测出样品透过率A后，忽略样品表面对光的反射，根据朗伯定律[8] I=I0e-αd，求出样品的吸收系数α随光能量变化的曲线。
2.3 血小板粘附实验
将新鲜抗凝兔血配制成浓度约为2000个/μl的稀释血小板悬浮液。样品浸泡在血小板液中，以3500r/min转速离心1min，用磷酸盐缓冲液PBS漂洗，2.5%戊二醛固定3h，再由乙醇系列脱水，乙酸异戊脂脱醇，经CO2临界点干燥后喷金。在JEO2000扫描电镜下观察血小板形态、聚积变形等情况，对每个样品，随机选取10个均匀分布的区域进行拍照，计算血小板的黏附数目和统计平均，并与参考样品对比。在高倍视野下(×2000倍)，观察血小板的形态。
3 实验结果和讨论
3.1 ta-C:H薄膜的微结构特性
图2是在衬底负偏电压分别为0、－20、－40、和－80V制备样品的吸收光谱，吸收曲线表明了ta-C:H薄膜有宽而平的吸收带。根据Dasgupta [9]等提出的a-C:H的态密度模型，ta-C:H薄膜的光吸收由具有准高斯分布的π态的吸收起主要作用，而且它们的光能隙在很大程度上依赖于π和π*态[10]。根据Tauc公式αE =B(E-Eg)2，从(αE)1/2 ~ hν 曲线可以得到样品的光学带隙[10]。图2中的插图为不同衬底负偏电压下，ta-C:H薄膜的光学带隙Eg。结果表明：在不同的衬底负偏电压下，所制备的ta-C:H薄膜的光学带隙不同，正如我们以前的实验结果，通过Raman光谱测量和分析[11]，在ta-C薄膜的沉积过程中，由于衬底偏压的不同，碳离子到达衬底的能量也不同，从而形成不同微结构的薄膜。由于ta-C:H薄膜是由类金刚石的sp3 C和类石墨的sp2 C两种键结构组成的，sp3 C形成无序网络构架，控制薄膜的机械性质，而sp2 C以6原子环的形式聚集成类石墨畴，嵌镶在sp3 C的网络构架中，控制薄膜的禁带宽度，ta-C薄膜中sp3 C组分越高，其半导体带隙越宽。
3.2 血小板粘附实验
在动脉中的血栓形成，最初的关键性的一步是血小板聚集。正常情况下，血液里的血小板并不互相粘连，也不会附着在血管壁上。血液与材料接触后，激活的凝血因子产生凝血酶，凝血酶出现后，血小板很快失去其圆球形状，伸出许多伪足。这种形状变化是可逆的，它促进聚集。发生聚集后，细胞紧密接触，伸出更大的伪足，这种变化是不可逆的[11]。不同材料因其表面性能不同，引起血小板聚集的情况也各异。因此可以通过观测材料表面粘附的血小板和形态来评价材料的血液相容性。粘附的血小板越少、形态变异越小，材料的血液相容性越好。
图3和图4表明了在不同衬底负偏电压下制备ta-C:H薄膜的血小板黏附实验结果。样品编号#1、#2、#3和#4分别对应于衬底偏压为0、－20、－40和－80V的ta-C:H薄膜，样品编号#5为阴性对照样品，美国PolyMedica公司生产的、临床应用较好的抗凝血生物材料“聚碳酸酯聚胺酯（Chrono flex）”，样品编号#6为抗凝血性能最差的玻璃作阳性对照。图3为血小板黏附实验的典型SEM照片，图4中(a)、(b) 和(c)分别为衬底偏压为－20V的ta-C:H薄膜、聚碳酸酯聚胺酯参考样品#6和玻璃样品#5。结果表明：聚碳酸酯聚胺酯参考样品表面的血小板形状完整，而玻璃表面的血小板形状有严重变异，并且有堆积现象出现。衬底偏压为－20V的ta-C:H薄膜表面粘附的血小板也没有发生很大形变，这说明ta-C:H薄膜可以有效抑制血小板与材料表面发生反应，抑制凝血过程的进行。通过对每个样品，随机选取10个血小板黏附均匀的区域进行拍照，并对样品所黏附的血小板数目进行统计，得到如图4所示的不同样品血小板黏附数目的统计结果，结果表明：在不同衬底偏压下制备的ta-C:H薄膜，血小板黏附量不同。当Vb=－20V时，ta-C:H薄膜表面粘附的血小板数量最少，比标准参考样品#5 (Chrono flex)表面粘附的血小板还要少，玻璃表面粘附的血小板数量最多。
4 结论
用磁过滤真空等离子沉积技术，在不同衬底负偏电压下（0～－80V）制备了四配位氢化非晶碳薄膜（ta-C:H）。紫外-可见吸收光谱结果表明ta-C:H薄膜的光学带隙在2.3～2.7eV之间变化，当衬底负偏电压Vb=－20V时，样品的光学带隙最小，不同光学带隙表明薄膜中sp3与sp2的含量不同。血小板粘附实验结果表明，在不同衬底偏压下制备的ta-C:H薄膜，血小板黏附量不同。当Vb=－20V时，ta-C:H薄膜表面血小板黏附量较少，而且表面粘附的血小板形貌也没有发生较大的变化，表明ta-C:H薄膜可以有效抑制血小板与材料表面发生反应，抑制凝血过程的进行，具有优良的抗凝血性能。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目（NSFC30370410）；广东省科技计划资助项目（202B11701）
作者简介：陈弟虎（1963－），男，四川绵阳人，教授，博士，硕士生导师，1989毕业于四川大学物理系，2000年获香港中文大学博士学位，主要从事功能薄膜材料的制备、性质及应用研究。
论文来源：中国功能材料及其应用学术会议,2004年,9月12-16日
