本发明涉及材料制备技术领域，尤其涉及一种两步法盐析纯化重组丝蛋白的方法。本发明的目的是提供工艺简单、成本低、操作方便的一种两步法盐析纯化重组丝蛋白的方法，包括下列步骤：（1）将含有目的基因表达质粒的大肠杆菌经发酵培养和IPTG诱导表达后，离心收集菌体，将其重悬于裂解缓冲液（pH 8.0，50 mmol/L NaH₂PO₄，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑）中，冰浴并超声波破碎后，离心（4℃，14500 rpm，10 min）收集上清，调节pH至6.0后，添加(NH₄)₂SO₄至20％饱和度，并于37°C静置2小时后离心（4℃，12000 rpm，20 min）收集上清液；（2）调节上清液的pH至6.0，添加(NH₄)₂SO₄至40％饱和度，并于37°C静置2小时后离心（4℃，12000 rpm，20 min）收集沉淀，经过真空干燥后得重组丝蛋白粉末。本发明的有益之处在于，每升培养基可以生产重组丝蛋白1 g左右，大大提高了重组蛋白的生产效率。