西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院陆飞副教授在化学领域知名期刊《International Journal of Biological Macromolecules》上发表最新研究成果。

纳米医学是纳米技术在医学上的应用，在诊断和治疗方面已取得重大进展。纳米药物载体具有体积小、修饰靶向、避免内皮系统清除、包封多种药物、延长药物在血液中的循环等优点。新型生物材料的应用，如脂质纳米载体、聚合物基纳米平台、超声响应载体和无机纳米颗粒等，已经得到了大量的研究。与其他递送平台相比，外泌体具有长期稳定性、低免疫原性和高载药能力等显著优势，是一种很有前景的治疗递送载体。外泌体是细胞外细胞衍生的磷脂纳米载体，直径为40-150 nm。它们携带DNA、RNA、蛋白质、脂质等小分子，可以将生物活性分子传递给特定的受体细胞。与来源于动物的外泌体相比，从可食用植物中提取的外泌体具有许多优势，包括成本效益和携带抗炎、抗氧化和再生特性的活性成分。因此，植物来源的天然脂质外泌体在药物传递和组织再生领域受到了极大的关注。来自不同植物的外泌体的脂质和蛋白质组成影响其药代动力学性质，其天然成分可能具有不同的功能。

近日，西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院陆飞副教授课题组在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表题为"Delivering urokinase-type plasminogen activator using mulberry leaf exosomes enables thrombolysis and remodeling of venous microenvironments"的研究成果（https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.136866）。该研究报道了一种以天然桑叶脂质外泌体为基础的纳米载药体系。成功构建针对静脉血栓栓塞的给药平台uPA/MLE@cRGD，通过静脉注射有效清除活性氧、促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转化。

在血栓形成的治疗中，常规纳米载体不可避免地存在不良反应、合成困难等问题。受“药食同源”概念的启发，我们从桑叶中提取并纯化了天然外泌体，作为运送尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）的载体，用于靶向治疗。所获得的桑叶外泌体（MLE）具有理想的流体动力学粒径（119.4 nm），尺寸分布均匀（多分散性指数= 0.174），表面电荷为负（- 23.3 mv）。在加载uPA之前，MLE被修饰了cRGD，以选择性地结合活化的血小板靶向血栓。流式细胞术研究显示MLE@cRGD具有74.3%的高血栓靶向能力。此外，MLE可以通过有效消除活性氧（ROS），促进巨噬细胞从M1向M2表型转化，从而重塑静脉微环境，进行静脉组织修复。

图1 uPA/MLE@cRGD的制备及其治疗静脉血栓栓塞的作用机制

透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）显示，MLE纳米颗粒表现出典型的外泌体形态，具有圆形的膨出结构（图2A, B）。纳米颗粒跟踪分析（NTA）结果显示，MLE的平均粒径为119.4 nm，粒径分布均匀（PDI=0.173）（图2E）。FTIR和XPS结果证实了MLE@cRGD的成功制备。

图2 结构表征

为了全面评估uPA/MLE@cRGD的细胞毒性，使用CCK-8法将HUVECs与纳米载体共培养72小时。为了评估细胞活力，在24，48和72小时，使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。如图3C所示，MLE, MLE@cRGD和uPA/MLE@cRGD与HUVECs共培养72小时后，纳米载体对HUVECs没有明显的细胞毒性。

图3 生物相容性

MLE和MLE@cRGD与活化血小板在37℃共孵育30 min后，采用激光共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞术评估靶向效果。如图4A，4B所示，大量MLE（绿色荧光）分散在活化血小板周围（蓝色荧光），一小部分MLE聚集在血小板周围。靶向肽接枝后，MLE@cRGD（绿色荧光）比MLE更多地聚集在活化血小板（蓝色荧光）周围，表明MLE@cRGD具有出色的靶向能力。

图4 体外靶向

经尾静脉注射Cy5.5-uPA和Cy5.5-uPA/MLE@cRGD （10 mg/kg）后，在不同时间点采集血清，用IVIS光谱系统记录荧光强度。注射后30 min, uPA的荧光信号开始消失，而uPA/MLE@cRGD的荧光密度在4 h时仍有明显的荧光信号，这证明MLE@cRGD显著延长了uPA在血液循环中的半衰期。不同给药组对股静脉血栓形成的治疗效果见图5F。uPA/MLE@cRGD的血栓块几乎完全溶解，但uPA组仍有小的血栓块未溶解，这可能是因为uPA在血液循环中代谢迅速，uPA/MLE@cRGD富集并长时间停留在血栓部位，发挥了uPA的溶栓功能。

图5 体内溶栓

如图6A所示，对照组的M2型巨噬细胞数量很少，而MLE和uPA/MLE@cRGD处理后，M2型巨噬细胞数量明显增加。uPA组虽然也能检测到M2巨噬细胞的红色荧光，但其强度和相对面积远低于MLE组。采用Image J软件定量分析M2巨噬细胞标志物CD163的红色荧光。如图6B所示，与PBS组的0.7%相比，MLE（6.5%）和uPA/MLE@cRGD（9.5%）的荧光面积分别增加了5.7%和8.7%，表明MLE显著促进了巨噬细胞从M1型向M2型转化。

图6 巨噬细胞表型转化

该研究为外泌体给药提供了重要参考。促进植物源性外泌体及其溶栓治疗作用的研究从实验室到临床可能还有很长的路要走；然而，这个领域是开放的，充满了潜在的机会。

西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院2022级硕士研究生管鹏鹏为本文第一作者，西南大学陆飞副教授为本文的通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、重庆市自然科学基金的资助。

课题组一直专注于针对创面止血与促愈用材料、体内溶栓药物载体的研究，近三年课题组成员共主持包括国防项目，国家自然科学基金，重庆市科技攻关项目，重庆市自然科学基金在内的20余项科研项目。在Advanced Functional Materials、Bioactive Materials、Chemical Engineering Journal等杂志上发表高水平SCI论文50余篇；已申请国家发明专利40项，其中已授权20余项。

本研究成果原文下载：

https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.136866